白血病的診斷與分型(一)

一、白血病診斷與分型及其相關技術概述

白血病是一組造血干/祖細胞惡變導致分化阻滯、凋亡障礙的異質性惡性腫瘤性疾病。絕大多數表現為骨髓(BM)和/或血液(PB)中的惡性造血系統或免疫系統細胞增加。

為了能指導臨床及科研，疾病的分型應有較好的重復性，并能反映疾病亞型的生物學及臨床特征，幫助判斷預后，指導制定治療方案及治療策略，監測療效，確定停止治療的時機。正常時所有的血細胞，如粒、單核、紅、淋巴細胞，以及血小板均來自BM的造血干細胞(HSC)。不同型白血病是造血干/祖細胞分化受阻于不同階段的結果，具有與正常造血細胞相對應的形態學、細胞化學、免疫學表型特征。但與正常細胞相比，有一些特征發生異常，以這些特征為依據，我們可以對白血病進行診斷及分型。

根據白血病細胞分化受阻的成熟階段及病程將白血病分為急性和慢性兩大類。急性白血病細胞分化阻滯在較早階段，故大部分細胞為原始細胞或異常早幼粒細胞，而慢性白血病細胞具有較大程度的分化成熟能力，大部分細胞為形態較正常的成熟細胞。根據白血病細胞的系列來源將其分為髓系及淋巴細胞系兩大類，前者包括紅、粒、單核、巨核細胞系白血病，后者包括T、B淋巴細胞系白血病。

光鏡及電鏡下觀察細胞形態及細胞化學染色是白血病診斷與分型的基礎方法。1976年，法、美、英三國的專家組成了FAB白血病分型協作組，提出了急性白血病的診斷標準及分型意見(Bennett等，1976)，以后進行了多次修改補充(Bennett等，1991，1985a，1985b，1981，1980)。FAB的分型簡單，易于在基層單位推廣。但尚存在較多的不完善之處：其重復性較差，只有60%～70%，對預后判斷、療效監測、指導治療的價值也不太大。隨著免疫學、細胞遺傳學及分子遺傳學、分子生物學的發展，甚至對疾病發病原因更深入的了解，發現綜合多種方法對白血病進行診斷和分型重復性更好、更客觀，且更能反映疾病亞型的生物學及臨床特征，能更好地幫助判斷預后，指導制定治療方案及策略，監測療效。

從1995年開始，衛生組織(WHO)成立了一個指導委員會，提出惡性血液及淋巴系統疾病的統一診斷與分型標準，分別于2001年、2004年、2008年修訂。白血病診斷與分型進入了整合診斷與分型的時代。WHO提出，在患者初次就診時，只要條件許可，盡可能給患者進行全面的檢查評估，除了全面病史、體格檢查、生化、三大常規、按病情所需進行的其它檢查外，特別要進行形態學、免疫學、細胞遺傳學與分子遺傳學、分子生物學，甚至病原學的檢測。

形態學分型技術包括以下兩方面，不同白血病原始細胞的形態和細胞化學染色見表1-1。(1)對PB涂片、BM穿刺液涂片，用瑞氏-姬姆薩或梅-格瑞-姬姆薩(May-Grunwald-Giemsa)染色后在光鏡下觀察形態。為了減少誤差，WHO(2008)要求觀察>；500個骨髓細胞，>；200個血液細胞，還需要觀察多張涂片的細胞來綜合報告。多種細胞化學染色反應也可幫助鑒別不同系列來源或不同成熟階段的細胞。對特殊患者甚至用電鏡觀察其超微結構及其細胞化學染色反應，一些光鏡下陰性的細胞在電鏡下可能陽性；不同細胞的超微結構染色反應不同，如髓過氧化酶(MPO)在原粒細胞的A顆粒粗面內質網、高爾基體和核膜均為陽性；血小板MPO(PPO)在原巨核細胞的內質網及核膜呈陽性，而高爾基體及顆粒陰性。(2)對BM活檢切片經不同染色后觀察。骨髓活檢病理檢查有以下方面的特殊作用：能更好地反映骨髓細胞的增生程度、細胞在組織結構中的定位、造血細胞的比例及成熟度、基質情況、是否合并纖維化，組織結構是否被破壞，活檢標本尚可用于IHC檢測。如果由于骨髓干抽等原因不能獲得骨髓涂片，還應用骨髓活檢標本印片觀察細胞形態。對于有骨髓纖維化、骨髓穿刺困難的患者，骨髓活檢尤其重要。

免疫學分型主要包括免疫組織化學染色技術(IHC)、流式細胞分析技術(FCM)。采用不同染料或熒光染料標記的單克隆抗體(mAb)對細胞懸液、細胞涂片或BM組織切片進行染色，然后在流式細胞儀或熒光顯微鏡或光鏡下觀察細胞表面或細胞內的抗原標記。一般說來，白血病細胞與正常造血細胞的抗原標志相近。由于不同成熟階段和不同系列來源的細胞表達不同的抗原標志，因此分析白血病細胞的抗原標志比形態學方法更易區分惡性細胞的系列來源及成熟階段。由于白血病細胞與正常造血細胞不同，有抗原表達紊亂、或紊亂分布的現象，因此免疫分型比細胞形態更易幫助鑒別細胞的良惡性，特別是對細胞形態較正常的外周(或成熟)的白血病。免疫學標志分析結合細胞形態及細胞化學染色方法，可將90-99%的急性髓性白血病(AML)與急性淋巴細胞白血病(ALL)區分開來(SecondMIC，1988)，重復性可提高至99%。一些白血病，尤其是多系列白血病、微分化型白血病的診斷在很大程度上依賴免疫分型技術。通過組合分析多種標志的表達、強弱、是否紊亂等，FCM可幫助確立監測殘留白血病(MRD)的標志，用FCM監測MRD的敏感性可達10-3~10-4。由于一些單克隆抗體(如抗CD20、CD52、CD33、CD19、CD22等的單抗)已經分別用于臨床治療這些抗原陽性的白血病，所以免疫分型還可以幫助指導單克隆抗體為基礎的靶向治療。有些免疫標志陽性的白血病預后不好(如CD34+CD56+的AML預后不好)，因此免疫分型尚有一定的預后意義。因為很多免疫標志在正常細胞上也存在，因此進行白血病免疫分型時應該確定免疫標志在白血病細胞上，而不是簡單地根據某一免疫標志的陽性細胞&ge；20%。例如，當原始白血病細胞只有20%，而正常粒細胞高達&ge；50%時，此時根據粒細胞標志細胞占全部有核細胞的50%就診斷急性粒細胞白血病是完全錯誤的。

染色體分析(細胞遺傳學分析)具有獨立的預后及指導治療的價值。如t(15；17)僅見于急性早幼粒細胞性白血病(APL)，對全反式維甲酸(ATRA)、砷劑及蒽環類藥物治療的療效好，其治愈率可達70-96%。而t(11；17)的APL對ATRA及砷劑的療效就不如t(15；17)者好。有t(9；22)染色體異常的ALL預后差，用酪氨酸激酶抑制劑(TKI)療效好等。染色體分析對的優點是可同時發現多種染色體異常；缺點是不太敏感、需要細胞活性好、白血病細胞要分裂才能反映其染色體異常，一些微小的染色體異常很難檢測出來，需要分析人員有豐富的經驗。因此用常規標準的顯帶和核型分析技術，容易漏檢或錯誤判斷一些染色體異常。熒光標記不同染色體或基因片段探針的原位雜交技術(FISH)可以檢測很微小的異常，可以檢測不分裂的細胞，分析的細胞數目明顯比染色體核型分析多，因此大大增加了染色體分析的敏感性和準確性。但是FISH技術使用的探針較昂貴，一次只能檢測一種或數種異常，同時檢測23對染色體的探針目前還很難常規用于臨床診斷，因此，目前FISH主要用幾種常見的異常染色體組合探針來診斷常見的染色體異常白血病，更多用于監測治療后的MRD，其敏感性可達10-3。

隨著分子生物學的發展，在白血病患者發現越來越多的融合基因或基因突變。一般來說，白血病融合基因是由染色體移位引起，如t(15；17)產生PML-RARA融合基因，但有時染色體異常為隱匿性異常，用常規的染色體核型分析技術檢測不出異常染色體，但用分子生物學方法能檢測出相應的融合基因，它們的生物學特性是一樣的。比如我們發現染色體正常但BCR-ABL陽性的ALL，與t(9；22)異常的ALL一樣對格列衛治療有效；染色體正常但PML-RARA基因陽性的APL同樣對全反式維甲酸及砷劑治療有效等。目前已發現數百種基因與白血病有關。多重巢氏PCR及基因芯片技術可快速檢測數百種白血病基因，這些基因可以幫助白血病的分型、判斷預后、指導治療和監測MRD。用基因擴增方法監測MRD，其敏感性可達10-4～10-6，是目前監測MRD敏感的指標。由于染色體和/或基因的獨特價值，WHO分型系統把特殊染色體和/或基因異常的白血病獨立分型，大大增加了它們的地位。

越來越多的研究發現，病原感染與某些類型的白血病有關，如成人T淋巴細胞白血病病毒(HTLV)與成人T細胞白血病/淋巴瘤(ATLL)有關，EB病毒(EBV)與淋巴系統白血病有關。而這些病原相關的白血病與臨床預后及治療選擇都相關。因此病原檢測也可能作為白血病(或惡性PB病)的分型指標之一。

由于目前FAB分型仍是基層醫院常用的分型標準，而2008年WHO分型是新的分型標準，故在本書中僅介紹這兩種分型標準。值得注意的是，WHO已經將惡性血液系統腫瘤分成了髓系、淋巴細胞系等幾大類，統稱為惡性血液及淋巴系統腫瘤，因為一些淋巴瘤、骨髓增殖性腫瘤(MPN)、骨髓增生異常綜合征(MDS)等與白血病只有微小的差異，如淋巴母細胞淋巴瘤(LBL)與急性淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)與小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、MDS與一些急性白血病等的生物學特征非常相似，它們的區分僅僅是根據惡性細胞在骨髓和/或血液的比例來確定。因此好全面了解WHO對惡性血液及淋巴系統疾病的全面分型(詳見附件)。由于本書主要介紹白血病，故以下僅介紹白血病的診斷與分型。

二、白血病的診斷步驟在診斷白血病時，我們重要的是要注意回答以下幾方面的問題。

(一)是正常細胞還是白血病細胞?急性白血病特征是造血前體細胞明顯增加，表現為原始細胞大量增加，良惡性細胞較容易鑒別，因為正常人BM的原始細胞一般<；2%，在PB幾乎不能發現。所以診斷急性白血病的主要標準是BM和/或PB中原始細胞比例。但是僅通過觀察細胞形態來鑒別原始細胞，僅憑原始細胞多少來判斷急性白血病可能會導致誤診。有時候形態學觀察到的原始或幼稚淋巴細胞可能為正常反應性增生的原始細胞，一些患者在感染或細胞因子治療后，尤其是在兒童患者，正常原始細胞可能升高；一些形態符合原始或幼稚細胞特征的細胞不是真正的原始細胞，而是成熟的細胞。相反，有時形態學不像原始細胞，而實際上為惡性造血前體細胞。慢性白血病以BM和/或PB中成熟血液系統細胞增加為主要表現，雖然一些細胞的形態有異常，但大多數很難僅憑形態學將良惡性細胞區分開來。因此鑒別良惡性細胞需要結合多種方法。1、形態學及病理方法原始細胞在BM、PB或其它部位明顯增加是急性白血病的特征。細胞體積增大，多種核畸形，核胞發育失衡，胞漿含Auer小體、顆粒過多或過少；細胞在骨髓或其它組織定位異常、破壞正常組織結構等。胞漿Auer小體是惡性髓系細胞的特征。2、免疫學方法(1)細胞上抗原表達異常雖然惡性造血或淋巴系統細胞的抗原與正常細胞表達相近，很少有惡性細胞特異的抗原標志，但是惡性細胞的抗原表達紊亂，表現為：一種系列的細胞表達另一系列細胞的抗原；發育早期與晚期的抗原同時表達；本應表達的抗原缺失；抗原表達過強或過弱；罕見標志的細胞明顯增多；在血液或其它外周器官中大量細胞上表達僅在胸腺或前體細胞上表達的抗原；細胞大小或細胞顆粒多少變化等。惡性B細胞抗原異常表達包括：一些非B細胞系列的標志如CD13、CD15、CD33、CD117、CD2、CD5、CD7、CD56與B細胞抗原如CD19、CD20、CD22、CD79a、細胞內或膜表面免疫球蛋白(Ig)共表達，而在正常B淋巴細胞上不表達；一些泛B抗原丟失；細胞增大導致前向角(FSC)變大，細胞內顆粒增多導致側向角(SSC)增高；CD45比正常成熟淋巴細胞明顯增強或減弱等。除了以上惡性B細胞的共性外，B-ALL常見的抗原異常表達是CD45、CD38、TdT表達缺乏或很弱；CD10、CD19、CD34表達是正常細胞的10倍。惡性T細胞抗原異常表達包括：大多數僅表達表達CD4或CD8，或CD4+和CD8+共表達，或CD3+的細胞不表達CD4及CD8；常常丟失一些泛T抗原CD2、CD3、CD5、CD7，或表達明顯減弱；一些非T細胞系列的標志如CD13、CD15、CD33、CD117、CD56、CD19、CD79a與以上泛T細胞抗原共表達；CD45比正常成熟淋巴細胞明顯增強或減弱；FSC、SSC增大。除了以上惡性T細胞的共性外，T-ALL常見的抗原異常表達是cCD3和TdT共表達，或cCD3與34共表達，CD1a與CD34及其它泛T細胞標志共表達。惡性髓系細胞抗原異常表達包括：一些非髓系的抗原如CD2、CD5、CD7、CD56、CD19、CD79a等與髓系抗原共表達；早期細胞的抗原與晚期細胞抗原共表達，如CD34與CD11b或CD14或CD15等共表達；丟失本應該表達的抗原，如在單核細胞上丟失CD14、CD33，在粒細胞上丟失Dr，原始細胞CD45dim或陰性等；CD34、CD117等抗原過度表達；FSC、SSC異常增大或SSC異常縮小。(2)B細胞的克隆性分析由于大多數外周(成熟)B細胞的胞漿內或細胞膜表面表達免疫球蛋白(Ig)，其輕鏈為&kappa；(kappa)或&lambda；(lambda)，正常B細胞上表達&kappa；與&lambda；的細胞數量比例為3:2。當某一群惡性B淋巴細胞增生時，細胞僅表達&kappa；或&lambda；(單克隆性)；而反應性增生或良性B淋巴細胞表達&kappa；與&lambda；的細胞數量比例為正常(多克隆性)。因此通過檢測表達&kappa；或&lambda；細胞的B細胞比例，可以了解細胞是否為單克隆增生的B細胞。當某一群細胞中表達&kappa；與&lambda；的細胞數量比例>；4:1，或<；1:2時，考慮為單克隆增生。圖3-2顯示了正常與惡性成熟B細胞的&kappa；與&lambda；的特點。用FCM檢測快速簡便，且容易定位于不同類型的細胞，已被常規用于成熟B細胞的克隆性分析。(1)T淋巴細胞的克隆性分析大多數成熟T細胞表面表達T細胞抗原受體(TCR)&alpha；/&beta；鏈，其V&beta；區具有多表位的抗原，不同個體該區的抗原有較大的多態性。目前用單抗可識別TCRV&beta；家族的多個表位的抗原，表達不同表位抗原的T細胞比例有一定范圍，如某一表位陽性細胞明顯增加，而其它表位陽性細胞明顯減少，要考慮為克隆性T細胞疾病(圖1-4顯示患者TCR&alpha；/&beta；鏈V&beta；區的某一表位細胞明顯增加，提示存在惡性T細胞)。目前用TCR-V&beta；家族的抗體對70%以上的惡性成熟T細胞疾病可確定其克隆性，但抗體多，檢測費用高，難以普及，目前已基本被TCR基因克隆性重排檢測替代，后者便宜。(1)細胞DNA濃度或細胞增殖周期分析惡性淋巴細胞由于染色體丟失或過多，FCM分析DNA的含量可發現細胞為亞二倍體、正常或超二倍體，從而幫助判斷細胞的良惡性。FCM可同時標記免疫抗原及DNA，因此可選擇不同標記的細胞來分析DNA濃度。通過對DNA及增殖抗原的分析，可以了解惡性細胞處于周期的比例，從而幫助判斷惡性淋巴細胞的惡性程度。增殖周期多的細胞進展快，增殖周期少的惡性程度低。3、染色體分析如檢測出染色體異常，且排除體質性或遺傳性異常，應高度考慮為惡性血液或淋巴系統細胞。4、基因分析白血病常有因染色體易位導致的特有融合基因或基因突變，據此可鑒別良惡性細胞。因為干細胞向淋巴細胞分化過程中，TCR和IgH基因的可變區(V)和結合區(J)基因會發生重排，即兩個距離很遠的片段重新排列在一起，形成新片段，所以免疫球蛋白重鏈(IgH)及T細胞受體(TCR)基因重排技術可幫助鑒別淋巴細胞是否為單克隆性增生。每個淋巴細胞都有各自的序列不同的TCR或/和IgH片段。白血病淋巴細胞增殖呈單克隆性，故如果只檢測出一種基因重排片段就考慮為單克隆性(圖1-5)。臨床醫生往往把IgH重排當作惡性B細胞腫瘤的標志，而把TCR&gamma；，TCR&delta；重排當作惡性T細胞腫瘤的標志，但IgH、TCR&gamma；、TCR&delta；重排并無系列特異性特征。偶然在AML患者亦可檢測到IgH和TCR基因的克隆性重排，即序列失真現象。有時一些非惡性疾病也可能檢測到IgH和TCR基因的克隆性重排，尤其是TCR基因重排，如EB病毒感染、移植后使用免疫抑制劑及一些皮膚T細胞良性增殖。檢測使用的標本太少也可能導致克隆性重排的假象。診斷時應仔細分析。

(二)是急性(前體)白血病還是慢性(或成熟、或外周)白血病?1、急性白血病的診斷急性白血病又被稱為前體細胞白血病，以BM和/或PB中原始細胞增多為主要特征，白血病原始細胞除了有形態學、細胞化學染色特征外，尚須具有前體細胞的免疫標志，造血前體細胞的共同標志是CD34+、TDT+、CD45弱陽性(dim)或陰性，髓系前體細胞為CD117+、CD64+/CD14-，B系前體細胞表達CD10(尚需結合其它)，T系前體細胞CD99+、CD1a+；且有免疫標志異常表達現象。一般來說，急性白血病起病急，數天至數十天起病，常常有血液中紅細胞、血小板、正常中性粒減少以及由此引起的臨床表現，如貧血、出血、發熱等。